Untuk Pembersihan Protein

Satu bahagian penting dalam penyelidikan bioteknologi adalah menggunakan teknik kejuruteraan protein untuk merekabentuk atau mengubah suai protein dengan sifat optimum untuk aplikasi perindustrian tertentu. Untuk melakukan saintis ini mesti dapat mengasingkan dan memurnikan protein yang menarik supaya kesesuaian mereka, spesifikasi substrat, tindak balas dengan ligan lain, dan aktiviti tertentu boleh dipelajari.

Tahap kemurnian protein yang diperlukan bergantung kepada penggunaan akhir protein yang dimaksudkan.

Bagi sesetengah aplikasi, ekstrak mentah mencukupi. Walau bagaimanapun, untuk kegunaan lain, seperti dalam makanan dan farmaseutikal, tahap kesucian yang tinggi diperlukan. Untuk mencapai beberapa kaedah penulenan protein ini biasanya digunakan, dalam satu siri langkah penyucian.

Setiap langkah penyucian protein biasanya menghasilkan beberapa tahap kehilangan produk. Oleh itu, strategi pemurnian protein yang sesuai adalah salah satu tahap pembersihan tertinggi dicapai dalam langkah-langkah paling sedikit. Pemilihan langkah-langkah yang digunakan bergantung pada saiz, caj, kelarutan dan sifat-sifat lain dari protein sasaran. Teknik berikut adalah paling sesuai untuk membersihkan satu protein sitosol tunggal. Pemurnian kompleks protein sitosolik lebih rumit dan biasanya memerlukan kaedah yang berbeza digunakan.

- Langkah pertama untuk membersihkan protein

intraselular

(di dalam sel) ialah penyediaan ekstrak mentah . Ekstrak ini akan mengandungi campuran kompleks semua protein dari sitoplasma sel, dan beberapa tambahan makromolekul, kofaktor, dan nutrien. Ekstrak mentah boleh digunakan untuk beberapa aplikasi dalam bioteknologi, bagaimanapun, jika kesucian adalah masalah, langkah pemurnian berikutnya mesti diikuti. Ekstrak protein mentah disediakan dengan penghapusan serpihan sel yang dihasilkan oleh lisis sel, yang dicapai menggunakan bahan kimia dan enzim, sonication atau French Press.

Serpihan dikeluarkan oleh sentrifugasi, dan supernatan itu pulih. Persediaan kasar protein ekstraselular dapat diperoleh dengan hanya mengeluarkan sel-sel dengan sentrifugasi.

Bagi aplikasi bioteknologi tertentu, terdapat permintaan untuk enzim termostable

: Enzim yang boleh bertolak ansur dengan suhu tinggi tanpa denatur, dan sambil mengekalkan aktiviti khusus yang tinggi. Organisma yang menghasilkannya kadang kala dikenali sebagai extremophiles. Pendekatan mudah untuk membersihkan protein tahan panas adalah untuk menafikan protein lain dalam campuran dengan pemanasan, kemudian menyejukkan larutan (dengan itu membolehkan enzim termostable untuk diperbaharui atau redisolve, jika perlu. Protein yang denatured itu kemudiannya akan dikeluarkan oleh sentrifugasi.

Langkah-langkah Penyucian Perantaraan Pada masa lalu, langkah kedua yang biasa untuk membersihkan protein dari ekstrak mentah adalah hujan

dalam larutan dengan kekuatan osmotik yang tinggi (i.e. penyelesaian garam). Asid nukleat dalam ekstrak mentah boleh dibuang dengan merangsang agregat yang terbentuk dengan streptomycin sulfat atau protinine sulfat. Presipitasi protein biasanya dilakukan dengan menggunakan amonium sulfat sebagai garam.

Protein yang berlainan akan mendakan dalam kepekatan amonium sulfat yang berbeza.

Secara amnya, protein berat molekul yang lebih tinggi mendakan dalam kepekatan ammonium sulfat yang lebih rendah. Pemendakan garam tidak biasanya membawa kepada protein yang sangat disucikan tetapi dapat membantu menghilangkan beberapa protein yang tidak diinginkan dalam campuran dan menumpukan sampel. Garam dalam larutan kemudian dikeluarkan melalui dialisis melalui tiub selulosa berliang, penapisan, atau kromatografi pengecualian gel. Protokol bioteknologi moden sering mengambil kesempatan daripada banyak kit yang tersedia secara komersial yang menyediakan penyelesaian siap untuk prosedur standard. Pemurnian protein sering dilakukan menggunakan penyaring dan kolom penyaringan gel yang disediakan. Apa yang perlu anda lakukan ialah ikut arahan dan tambahkan jumlah yang tepat penyelesaian yang betul dan tunggu tempoh masa yang ditetapkan semasa mengutip eluant (apa yang keluar hujung lajur yang lain) dalam tiub ujian baru. Kaedah kromatografi boleh digunakan menggunakan lajur bangku atas atau peralatan HPLC automatik. Pemisahan oleh HPLC boleh dilakukan melalui kaedah fasa terbalik, pertukaran ion atau pengecualian ukuran, dan sampel yang dikesan oleh pelbagai diod atau teknologi laser. Visualisasi dan Penilaian Protein

kromatografi fasa terbalik

(RPC) memisahkan protein berdasarkan relatif

• hidrofobik

  . Teknik ini sangat selektif tetapi memerlukan penggunaan pelarut organik. Sesetengah protein secara kekal disenarai oleh pelarut dan akan kehilangan fungsi semasa RPC. Oleh itu, kaedah ini tidak digalakkan untuk semua aplikasi, terutamanya jika protein sasaran diperlukan untuk mengekalkan aktiviti.

  • Kromatografi Ion-pertukaran merujuk kepada pemisahan protein berdasarkan caj . Lajur boleh disediakan untuk pertukaran anion atau pertukaran kation.
  • Pertukaran anion mengandungi fasa pegun dengan cas positif yang menarik protein berprotein negatif. Kation pertukaran lajur adalah manik berbalik, berulang negatif yang menarik protein berprestasi positif. Pengelakan protein sasaran dilakukan dengan mengubah pH di dalam lajur, yang menghasilkan perubahan atau peneutralan bagi kumpulan fungsi yang dikenakan protein setiap protein. Kromatografi pengecualian saiz ( penapisan gel ) memisahkan protein yang lebih besar daripada yang kecil kerana molekul yang lebih besar bergerak lebih laju melalui polimer silang silang dalam ruang kromatografi. Protein besar tidak sesuai ke liang polimer sedangkan protein yang lebih kecil lakukan, dan mengambil masa lebih lama untuk bergerak melalui ruang kromatografi, melalui laluan kurang langsung mereka. Eluate dikumpulkan dalam satu siri tiub yang memisahkan protein berdasarkan masa elusi. Penapisan gel adalah alat yang berguna untuk menumpukan sampel protein kerana protein sasaran dikumpulkan dalam isipadu elusi yang lebih kecil daripada pada mulanya ditambah pada lajur.Teknik penapisan yang sama mungkin digunakan semasa pengeluaran protein berskala besar kerana keberkesanan kos mereka. Kromatografi afinitas
  • adalah teknik yang amat berguna untuk "menggilap" atau menyelesaikan proses pembersihan protein. Manik dalam lajur kromatografi disambungkan kepada ligan yang mengikat secara khusus kepada protein sasaran. Protein kemudiannya dikeluarkan dari ruang dengan membilas dengan larutan yang mengandungi ligan bebas. Kaedah ini memberikan hasil yang paling murni dan aktiviti spesifik tertinggi berbanding dengan teknik lain. SDS-PAGE adalah elektroforesis gel polyacrylamide, dilakukan di hadapan SDS (sodium dodecyl sulfate) yang mengikat protein yang memberi mereka cas negatif yang besar. Oleh kerana caj semua protein adalah sama, kaedah ini memisahkannya hampir sepenuhnya berdasarkan ukuran. SDS-PAGE sering digunakan untuk menguji kesucian protein selepas setiap langkah dalam satu siri. Oleh kerana protein yang tidak diingini secara beransur-ansur dikeluarkan dari campuran, jumlah band yang divisualkan pada gel SDS-PAGE dikurangkan, sehingga hanya ada satu kumpulan yang mewakili protein yang dikehendaki.
  • Immunoblotting adalah teknik visualisasi protein yang digunakan dalam kombinasi dengan kromatografi afiniti. Antibodi untuk protein tertentu digunakan sebagai ligan pada lajur kromatografi afiniti. Protein sasaran disimpan di lajur, kemudian dibuang dengan membilas lajur dengan larutan garam atau agen lain. Antibodi yang dikaitkan dengan label radioaktif atau dye membantu dalam mengesan protein sasaran sebaik sahaja ia dipisahkan dari sisa campuran.
• Sumber: Zubay G. 1988. Biokimia, Edisi ke-2. Macmillan Publishing Co., New York, NY, Amerika Syarikat.
• Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Buku Panduan Pembersihan Protein, Edisi AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, Amerika Syarikat. // www. biokim. uiowa. edu / donelson / Pangkalan Data% 20items / protein_purification_handbook. pdf.