Untuk DNA Pengecutan

Bidang bioteknologi adalah salah satu perubahan yang berterusan. Pertumbuhan pesat dan perkembangan penyelidikan canggih bergantung pada inovasi dan kreativiti saintis dan keupayaan mereka untuk melihat potensi dalam teknik molekul asas dan menerapkannya pada proses baru. Kemunculan PCR membuka banyak pintu dalam penyelidikan genetik, termasuk cara analisis DNA dan pengenalpastian gen yang berbeza berdasarkan urutan DNA mereka.

Penjujukan DNA juga bergantung pada keupayaan kami menggunakan elektroforesis gel untuk memisahkan helai DNA yang berbeza mengikut saiz sepasang pasangan asas.

DNA Sequencing

Pada akhir 1970-an, dua teknik penjujukan DNA untuk molekul DNA yang lebih lama dicipta. Ini adalah kaedah Sanger (atau dideoxy) dan kaedah Maxam-Gilbert (cleavage kimia). Kaedah Maxam-Gilbert didasarkan pada perpecahan khusus nukleotida oleh bahan kimia dan paling baik digunakan untuk menjejaki oligonukleotides (polimer nukleotida pendek, biasanya lebih kecil daripada 50 pasang asas panjang). Kaedah Sanger lebih kerap digunakan kerana ia telah terbukti secara teknis lebih mudah diterapkan, dan, dengan adanya PCR dan automasi teknik, mudah diterapkan pada helai panjang DNA termasuk beberapa gen keseluruhan. Teknik ini berdasarkan penamatan rantai oleh dideoxynucleotides semasa reaksi pemanjangan PCR.

Kaedah Sanger

Dalam kaedah Sanger, helai DNA untuk dianalisis digunakan sebagai templat dan polimerase DNA digunakan, dalam tindak balas PCR, untuk menghasilkan helai percuma menggunakan primers.

Empat campuran tindak balas PCR yang berbeza disediakan, masing-masing mengandungi peratusan tertentu analog dideoxynucleoside triphosphate (ddNTP) kepada salah satu daripada empat nukleotida (ATP, CTP, GTP atau TTP). Sintesis strand DNA baru berterusan sehingga salah satu daripada analog ini diperbadankan, di mana sehelai helai dipotong awal.

Setiap reaksi PCR akan berakhir yang mengandungi campuran panjang DNA lembaran yang berlainan, semuanya berakhir dengan nukleotida yang dideoxy dilabelkan untuk reaksi tersebut. Elektroforesis Gel kemudian digunakan untuk memisahkan helai empat tindak balas, di empat lorong berasingan, dan menentukan urutan templat asal berdasarkan pada berapa panjang helai berakhir dengan apa yang nukleotida.

Dalam tindak balas Sanger automatik, primer digunakan yang dilabel dengan empat tag neon berwarna yang berlainan. Reaksi PCR, di hadapan nukleotida dideoksi yang berbeza, dilakukan seperti yang diterangkan di atas. Walau bagaimanapun, seterusnya, empat campuran tindak balas kemudian digabungkan dan digunakan pada lorong satu gel. Warna setiap serpihan dikesan menggunakan sinar laser dan maklumat dikumpulkan oleh komputer yang menghasilkan kromatograms yang menunjukkan puncak bagi setiap warna, dari mana urutan DNA templat dapat ditentukan.

Biasanya, kaedah penjujukan automatik hanya tepat untuk urutan sehingga maksimum 700-800 pasangan pasang panjang. Walau bagaimanapun, adalah mungkin untuk mendapatkan urutan penuh gen yang lebih besar dan, sebenarnya, seluruh genom, menggunakan kaedah langkah bijak seperti urutan Primer Walking dan Shotgun.

Dalam Primer Walking , bahagian yang boleh dipelajari dari gen yang lebih besar diurutkan menggunakan kaedah Sanger. Primer baru dihasilkan dari segmen yang boleh dipercayai urutan dan digunakan untuk terus menyusun bahagian gen yang berada di luar jangkauan tindak balas asal.

Sequencing Shotgun melibatkan secara rawak memotong segmen DNA yang menarik ke dalam serpihan bersaiz yang lebih sesuai (terkendali), menyusun setiap serpihan, dan menyusun potongan berdasarkan urutan bertindih. Teknik ini telah dibuat lebih mudah dengan penggunaan perisian komputer untuk mengatur kepingan-kepingan yang bertindih.